Eine Einführung in Assay-Methoden für Rest-Wirts zell-DNA in biologischen Produkten

Wirtszellen sind der Eckpfeiler biologischer Produkte, und Säugetier zelllinien sind heute die am häufigsten verwendeten Wirte für die Expression und Herstellung biologischer Produkte. Häufige Wirtszellen sind Chinese Hamster Ovariy (CHO)-Zellen, Vero-Zellen aus afrikanischen grünen Affen nieren und Human Embryo nonic Kidney (HEK 293)-Zellen.

Risiko von Rest-Wirts zell-DNA

Karzinogen ität

Der primäre krebser zeugende Mechanismus vonVerbleibende Wirtszell-DNAIst die Einführung dominanter Onkogene wie MYC und RAS. Diese dominanten Onkogene können normale Zellen direkt transformieren, was dazu führt, dass sich einige normale Zellen in Tumorzellen differenzieren. Insertion mutationen der verbleibenden Wirtszell-DNA sind ebenfalls potenzielle krebser zeugende Faktoren.

Infekt iosität

Restliche Wirtszell-DNA kann infektiöse Virus genome enthalten, die durch Replikation und Transkript ions amplifi kation infektiöse Virus partikel produzieren können. Daher könnte das Infekt iosität risiko für verbleibende Wirtszell-DNA höher sein als das krebser zeugende Risiko.

Immun ogenität

Da genomische DNA aus mikrobiellen Quellen reich an CpG und nicht methyl ierten Sequenzen ist, erhöht sie das Immun ogenitäts risiko rekombinanter Protein medikamente in vivo. Beispiels weise können CpG-reiche Sequenzen von Bakterien Immunantworten auslösen, die durch TLR (Toll-like-Rezeptoren) vermittelt werden.

Nachweis methoden von Rest-Wirts zell-DNA

DNA-Sonde Hybrid isierung

Bei diesem Verfahren wird die exogene DNA in der Test probe zu Einzelst rängen denaturiert und an einer Fest phasen membran adsorbiert. Unter bestimmten Bedingungen kann es mit komplementären einzels trängigen DNA-Sonden, die mit Markern markiert sind, neu hybrid isieren, um doppels trängige DNA zu bilden. Die Detektion sergeb nisse der Hybrid isierungs methode weisen jedoch signifikante Diskrepanzen mit dem tatsächlichen Rest-Wirtszell-DNA-Gehalt auf, und das Verfahren ist mit relativ langen Nachweis zeiten instabil.

Fluor zierende Färbung

Diese Methode verwendet doppels trängige DNA-Fluoreszenz farbstoffe, die spezifisch an doppels trängige DNA binden, um Komplexe zu bilden, und erzeugt ein starkes Fluoreszenz signal, wenn sie bei einer Wellenlänge von 480 nm angeregt wird. Das Fluoreszenz signal bei 520 nm wird unter Verwendung eines Fluoro meters detektiert. Die Fluoreszenz intensität ist proportional zur DNA-Konzentration. Das Fluoreszenz signal dieser Methode wird jedoch leicht gestört und weist eine schlechte Spezifität auf, was die Vermeidung einer DNA-Kontamination in der Umgebung erfordert. Alle verwendeten Materialien und Reagenzien müssen DNA-frei sein.

Quantitative PCR

Derzeit ist diese Technik die konvention ellste Methode zum Nachweis von Wirtszell-DNA (HCD) und umfasst eine Echtzeit überwachung des PCR-Prozesses durch fluor zierende Signale, um die Matrize quantitativ zu analysieren. Basierend auf chemischen Prinzipien kann es in zwei Arten unterteilt werden: die TaqMan-Sonden methode und die SYBR-Farbstoff methode.

Das TaqMan-Sonden verfahren verwendet gen spezifische Oligo nukleotid sonden, die während der PCR-Reaktion mit Fluoreszenz farbstoffen markiert sind, um das Produkt nachzuweisen, während das SYBR-Farbstoff verfahren dem PCR-Reaktions system einen Überschuss an Fluoreszenz farbstoff hinzufügt. Der Farbstoff wird spezifisch in den DNA-Doppelstrang eingebaut und emittiert ein Fluoreszenz signal. Die TaqMan-Sonden methode erhöht die Spezifität durch den Sonden erkennungs schritt, während die SYBR-Farbstoff methode einfacher und einfacher ist.